X
Ana Sayfa Eğitim Takvimi Eğitimlerimiz Sertifika Programları Eğitmenlerimiz Forum Referanslar iletişim
Konu Aç

40 Konu

Makaleler

Eğitimler

Oyun

Haberler

Eğlence

Zeka Soruları

Forum Şifresini Unuttum
SGK Prim Sorgulama
Facebookta gangnam style işareti yapma
Facebookta gangnam style işareti nasıl yapılır?
Dosya Masrafı İadesi Geri Alma Dilekçesi
Kart Aidatlarini Geri isteme Dilekçesi
Referans Mektubu Örneği
REFERANS MEKTUBU ÖRNEKLERİ
Anasayfa Anasayfa > KİMYA MÜHENDİSLİĞİ > Genel Kimya Mühendisliği Konuları > Analitik Kimya ve Enstrümental Analiz
  Yeni Mesajlar Yeni Mesajlar RSS - Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC)
  Yardım Yardım  Forum Araması   Foruma Kayıt Olun Foruma Kayıt Olun  Giriş Giriş

Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC)

 Cevap Yaz Cevap Yaz   Yeni Konu Cevap Yaz
Yazar
Mesaj
  Başlık Arama Başlık Arama
meredithgrey Açılır Kutu Gör
Yönetici
Yönetici
Avatar
Merve

Kayıt tarihi: 07.Temmuz.2007
Konum: İstanbul
Durum: Offline
Puanlar: 724
Süreç Yönetimi Eğitimi
Mesaj Seçenekleri Mesaj Seçenekleri   Teşekkürler (0) Teşekkürler(0)   Alıntı meredithgrey Alıntı  Cevap YazCevap Mesajın Direkt Linki Başlık: Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi (HPLC)
    Gönderildi: 08.Eylül.2007 saat 11:23

YÜKSEK PERFORMANS SIVI KROMATOGRAFİSİ (HPLC)

Sıvı kromatografisi yönteminin özel bir uygulaması olan yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) yönteminde, sabit faz olarak kullanılan parçacık boyutlarının önemli ölçüde küçültülmesi sonucu hareketli faz ile etkileşen sabit faz yüzey alanı büyür ve böylece kolonun etkinliği arttırılmış olur. Çok sıkı olarak doldurulmuş kolondan hareketli fazın belirli bir hızla geçebilmesi için bir basınç uygulanması gerekir. Bu yüksek verimdeki kolonların ve oldukça yüksek basınçların kullanıldığı HPLC, element türlendirilmesinde en yaygın biçimde uygulanan kromatografi türüdür.

HPLC günümüzde kimya, biyokimya, biyoteknoloji, farmakoloji, tıp kimyası, bitki kimyası, tarım ve kimya mühendisliğini içeren alanlarda ayırma ve analiz için vazgeçilmez bir araç olarak kabul edilmektedir. Bilhassa diğer kromatografik tekniklere uygun olmayan bileşiklerin ayrılması ve analizi için uygundur. Çevre sıcaklığında termal olarak kararsız bileşikleri ve yüksek polarlıktaki bileşikleri herhangi bir türevlendirme olmaksızın ayırabilir ve analiz edebilir.

HPLC�nin sıvı kromatografisinin diğer türlerinden üstünlükleri şunlardır:

·        HPLC kolonu, rejenerasyon olmaksızın pek çok kez kullanılabilir.

·        Böyle kolonlarda gerçekleştirilen ayırma, eski yöntemlerle elde edilenden çok daha çeşitlidir.

·        Bu teknik kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve tekrarlanabilirlik daha yüksektir.

·        Nicel analiz amaçları için de kullanılabilir.

·        Analiz süresi çok kısadır.

·        Duyarlık çok yüksektir, 10 mg lık bir örnek bile, floresans veya elektron yakalama dedektörleri kullanılarak tayin edilebilir.

 

Şekil 1�de görülen  HPLC cihazı başlıca üç bölümden oluşur:

·        Çözücü dağıtma bölümü

·        Ayırma kolonu

·        Dedektör ve kaydedici sistem

 

 

01. Çözücü Dağıtma Sistemi

 

HPLC cihazı, diğer sıvı kromatografisi cihazlarından, daha önce de belirtildiği gibi, kolon giriş ve çıkışı arasında oluşturulması gereken yüksek basınç nedeni ile farklılık gösterir. Bu basınç farkı, kolon girişine bir pompa yoluyla uygulanan basınç ile sağlanır. Çözücü pompalama sistemi  belki de HPLC sisteminin en önemli kısmıdır. Pompanın performansı, analitik sonuçlardaki tekrarlanabilirliği, nicel değeri, gözlenebilme sınırı vb. değerleri büyük ölçüde etkiler. Ticari olarak mevcut pompalama sistemlerinin farklı tipleri şunlardır:

 

·      Doğrudan gaz basınç pompaları

·      Pnömatik hızlandırıcı pompalar

·      Pistonlu pompalar

·      Şırınga tipi pompalar

Doğrudan gaz basınç pompalarında, yüksek basınçta sıvı akışının sağlanması, genellikle azot veya helyum gazının kullanılmasıyla olur. Gaz basıncı, hareketli fazın yüzeyine doğrudan veya bir diyafram yoluyla uygulanır. Bu sistem sınırlı bir hacme sahiptir, bu yüzden durdurularak tekrar çözücü ile doldurulmalıdır. Avantajı, ucuz ve tek hareketli faz kullanıldığında güvenilir olmasıdır.

Pnömatik (havalı) pompalar da gaz basıncıyla çalışır. Gaz basıncı küçük alanlı bir pistonu iten büyük alanlı bir pistona etki eder. Gaz basıncı böylece pistonların yüzey alanları oranında kuvvetlenir. Sabit basınçtaki sıvı sisteme dağıtılır. Sıvının pompayı terketme hızı, çözücünün vizikositesine, pompa çıkışındaki akışın direncine ve kolon dolgu maddesiyle olan etkileşimine bağlıdır.

Pistonlu (sabit akış ) pompaları iki modeldir. Birinde piston, pompalanan hareketli sıvı faz ile doğrudan temas halindedir. Diyafram pompaları olarak adlandırılan diğerinde ise, piston hareketi hidrolik sistem yoluyla esnek paslanmaz çelik membrana iletilir. Bu pompaların piston hareketi nedeniyle çözücü,  sabit akış hızında, havalı pompalardan daha seri pulslarla dağıtılır. Çözücünün pulslu akışı ile dakikada 25 -100 piston hareketi (strok) üretilir. Pompalardaki sıvı akışı genellikle 10 mL.dak-1e kadardır.

Şırınga tipinde pompalarda,  elektriksel olarak hareket eden kurşun vida, verilen çözücü hacmini yeterli basınçta tutan bir pistonu hareket ettirir. Bu pompaların başlıca avantajı, yüksek basınçta (7500 psi�a kadar) serbest pulslu akış sağlama yetenekleridir ve akış hızı, çalışılan basınçtan bağımsızdır.

Pompaların aynı zamanda çözücü oranlarını da değiştirebilecek  şekilde proglanabilmesi, çözücü programlaması adı verilen ve çok daha etkin bir ayırmayı sağlayan tekniğin uygulanmasına olanak verir.

Çözücüler, ayırma kolonuna girmeden önce karıştırılırlar. Bu sistem gerekli ayırmayı sağlamakta kullanılan iki hareketli faz için, iki yüksek basınç pompasına sahiptir (Şekil 2). Bu amaçla kullanılacak iki hareketli fazın tamamen karışabilir olması gerekir. Pompalar yoluyla çözücüler,  ya difüzyon ya da mekanik olarak çalışan küçük hacimdeki karıştırma odalarında karıştırılırlar.

 

 

 

Sıvı kromatografisinde, iki farklı örnek enjeksiyon sistemi kullanılır.

A.  Hareketli faz akışı olurken; Septum yoluyla  kolon başına mikroşırınga ile enjeksiyon,

      Hareketli faz akışının durdurulmasıyla septum yoluyla enjeksiyon,

      Kolonun hemen başında hareket eden faza septum yoluyla enjeksiyon.

B.  Dış ilmek subabı (valfi)yoluyla enjeksiyon.

Şırınga enjeksiyonları, iç hacmi mümkün olduğunca küçük olması gereken bir septum enjektörü vasıtasıyla yapılabilir. Bu basit alet, dolgu maddesine yapılan (kolon üzeri enjeksiyon)  ve akışı durdurarak yapılan enjeksiyonlar (stop-flow) için iyi sonuçlar verir. Kolon üstü septum enjeksiyonu yapılırken alınması gereken önlem, iğnenin kolon dolgu maddesine temas etmemesidir.

Örnek, hareketli faz kolona girmeden önce de enjekte edilir. Bu yöntem kolon dolgu maddesinin herhangi bir zarar görmesinin önüne geçer. Fakat bu yöntemde, pompa, basıncın atmosferik basınca düşmesi için kapatılır, sonra örnek enjekte edilir ve pompa tekrar çalıştırılır. Bu yüzden alıkonma zamanında belirsizlik yaratabilir. Septum enjeksiyon teknikleri, küçük hacimli örnekler kullanıldığında uygulanır.

Valf enjeksiyonları, bölme kullanılmaksızın, 5000 psi dan yüksek basınçta çalışacak şekilde dizayn edilmiş, ince borulu ilmek(loop)lerdir. Bunlar, hareketli faz,  by-pass yoluyla kolona pompalanırken, örnek ilmeğinin doldurulması yoluyla çalışırlar. Örnek ilmeği, 10-500 ml �lik bir hacim aralığında, ya dıştan ve değiştirilebilir, ya da içten ve sabit hacim ilmeği olabilir. Nicel analiz için valf enjeksiyon aletleri, septum enjektörlere göre bazı avantajlara sahiptir:

I.     Yüksek tekrarlanabilirlikle, geniş bir aralıktaki örnek hacimlerini enjekte etme yeteneği,

·        Çözücü akışını durdurmaksızın yüksek basınçta (5000 psi) enjeksiyon olanağı,

·        Kolon tıkanmasına neden olan septumun bulunmaması,

·        Örnekleme sistemi için otomasyon.

 

 

02. Kolonlar

 

HPLC cihazında kullanılan kolonlar, yüksek basıncı korumak için paslanmaz çelikten yapılmışlardır. Bunlar baştan başa düzgün bir iç çapa sahiptirler ve ticari olarak değişik büyüklüklerde mevcutturlar.

Bir kromatografik sistemin performansı, kolonda gerçekleştirilen ayırma ile  yani, kolon dolgu maddesinin seçilmesi ve kullanılmasıyla tayin edilir.

Iyi bir kolon dolgu maddesi kararlı olmalıdır ve hem hareketli faz çözücülerine hem de örnek çözeltilere karşı inert olmalıdır. Geniş yüzey alanına, düzgün olarak dağılmış ve hareketli faza kolay erişebilir açık yapısal yüzeye sahip olmalıdır.Yüksek basınçve yüksek akış hızlarından etkilenmemelidir.

Kolon verimi; kolon dolgu maddesi, ortalama parçacık çapı, kolonu doldurmak için kullanılan teknikler, kolonun iç çapı ve kolonun iç yüzeyinin geometrisi gibi pek çok faktör tarafından tayin edilir. Paslanmaz çelik kolonların, malzeme özellikleri açısından en uygun kolonlar olduğu ortaya çıkmıştır. Analitik uygulamalarda, 2.1 mm, 3.2 mm ve 4.5 mm iç çapa sahip kolonlar 10-30 cm arasındaki uzunluklarda kullanılırlar.

Enjeksiyon sistemi-kolon ve kolon-dedektör arasındaki bağlantı borularının uzunluğunun mümkün olduğu kadar küçük tutulması istenir. Kolon çıkışına ve dedektör sistemine bağlanmış boruların en iyisi, hareketli fazla önemsiz ölçüde seyrelmeye izin veren minimum ölü hacme sahip olanıdır. Bu örnek seyrelmesini engelleyen, 0.025-0.05 cm iç çapa sahip (çelik ve teflon) bağlantı borularının kullanılmasıyla başarılır.

HPLC çalışmalarında sabit faz olarak genellikle silikajel kullanılır. Içerdiği SiOH grupları nedeniyle zayıf asidik özellik gösteren silikajel, bazik özellik gösteren bileşikleri bazlık kuvvetlerine göre tutar.Yani, kuvvetli bazlar silikajel kolonlarda zayıf bazlara oranla daha kuvvetli tutulurlar. Silikajel doğrudan dolgu maddesi olarak kullanıldığı gibi bir katı yüzeyine film halinde kaplanabilir. Bu katının cam boncuk olması durumunda bu ince tabaka, yüzeye kimyasal bağlarla bağlanır. Asidik özellik gösteren bikeşiklerin ayrılmasını sağlayan, yani bazik özellik taşıyan bir kolon dolgu maddesi de aluminadır. Bu dolgu maddesi de katı bir yüzeye film halinde kaplanarak kullanılır.

Elementel türlendirme amacı ile kullanılan dolgu maddesi ise genellikle anyon veya katyonları tutan iyon değiştirici reçinelerdir. Bu reçinelerin kullanılması durumunda örnekte iyon halinde bulunan türlerin birbirinden ayrılması sağlanabilir. Kullanılan iyon değiştirici reçineler doğrudan kolona doldurulabilen katı reçineler olabileceği gibi, bir katı yüzeyine kaplanmış sıvı reçineler de olabilir. Iyonların bu reçinelere olan ilgilerine etki eden birçok faktör vardır. Bunlar; iyonların yükü ve büyüklüğü, pH, iyon şiddeti, kullanılan reçinenin gözenekliliği, çözücü cinsi, çözücü derişimi ve sıcaklıktır.

Birkaç bileşenden oluşan bir karışımdaki her bileşen, farklı bir net yüke sahiptir ve bu yüzden kolondan ayrılması için farklı bir iyonik kuvvet gerektirir. Iyonik kuvvet tamponun veya tampona eklenen tuzun artan derişimiyle artabilir. Bu örneğin kolonda alıkonmasını azaltabilir ve bileşikler farklı tuz derişimlerinde kolondan ayrılırlar.

Örnek bileşenlerinin ayrılması, tamponun pH�ının değiştirilmesiyle sağlanabilir. pH, molekülün pI sına yaklaştığında molekül kendi yükünü kaybeder ve iyon değiştiriciden kurtulur. Katyon değiştirmede, örnekler kendi pI değerlerinin altında bir pH�da tutulduğunda, tamponun pH�ının artmasıyla örnek kolondan daha çabuk ayrılır.

Iyon değiştirme, iyonik türlerden birinin diğeriyle yer değiştirmesini içerir. Sabit faz, iyon değiştirici R+ vermek için, net pozitif yük taşıyan katı bir matriksten oluşur. Eğer anyon içeren hareketli faz kullanılırsa, R+(iyon değiştirici taraf) negatif karşı iyonu kendine doğru çeker, böylece örnek anyonları (X-), karşı iyonlarla (Y-) yer değiştirir.

                            R+Y- + X- = R+X- + Y-

Bu yöntem anyon değişimini içerdiğinden, anyon değiştirme olarak bilinir.

Yüzey, iyon değiştirici R- vermek için, net negatif yük taşıdığı zaman  katyon değiştirme olayı meydana gelir. Karşı iyonlar ( Y+) ve örnek iyonlarının (X+)  ikisi de katyondur ve iyon değiştirme şu şekilde olur :

                               R-Y+ + X- =R-X+ + Y+

Anyon ve katyon değiştirici reçinelerde gerçekleşen ayırma mekanizmaları Şekil 3�de görülmektedir

 

 

Şekil 3.a.  Anyon değiştirme reçinesindeki ayırma mekanizması.

 

Şekil 3.b.   Katyon değiştirme reçinesindeki ayırma mekanizması.

 

İyon değiştirme kromatografisinde, kromatografik destek maddesi, hareketli fazda iyonik çözeltilerle yer değiştirme yeteneğine sahip iyonları içerir. Iyon değiştiricilerin iki tipi; bazik ve nötral maddeler için katyon değiştiriciler, asidik ve nötral maddeler için anyon değiştiricilerdir.

Iyon değiştiriciler kimyasal özellik ve boyut farklılıkları kadar, yapısal farklılıklarına göre de  sınıflandırılırlar.

I. Mikrogözenekli veya jel yapısındaki reçineler: Bu reçineler mikro gözenekler içeren, çapraz bağlı yapısal bir ağdan oluşmaktadır. Çok küçük gözeneklere sahip olduğundan polar olmayan çözücü sistemlerinde, şişme çok düşüktür.Büyük hacimlerdeki iyonların tuttunması yavaştır ve çoğu kez tersinmezdir (Şekil 4.a).

II. Makrogözenekli reçineler: Bu reçineler mikrogözenekli reçinelere ek olarak, geniş büyüklükte gözenekler de içerir. Bunlar büyük iç yüzey alanlarına ve yüksek gözenekliliğe sahiptir. Büyük gözenekler, farklı büyüklükteki iyonların iyon değiştirici fonksiyonel gruplara kolayca ulaşmasını sağlayan kanallar içerir (Şekil 4.b).

III. Pelikular reçineler: Bu reçineler, cam boncuklardan oluşmuş iç kısma, iyon değiştirici ince bir reçine filminin kaplanmasıyla hazırlanır. Iç kısmın çapı çok küçüktür ve bu yüzden çözücülerin çok küçük miktarları için uygundur (Şekil 4.c).

IV. Yüzeysel gözenekli reçineler: Cam boncuklardan oluşmuş katı iç kısım, üzerine iyon değiştiricinin bağlandığı silika mikroküreciklerinin ince tabakasıyla çevrilir (Şekil 4.d).

 

Şekil 4.  (a) Mikrogözenekli reçineler; (b) Makrogözenekli reçineler; (c) Pellikular reçineler; (d) Yüzeysel gözenekli reçineler.

 

HPLC destek maddeleri hem silika temelindeki maddeleri hem de türevlendirilmiş hidrofilik veya hidrofobik polimerleri kapsar.
a)    Polimer temelli iyon  değiştiriciler: Polimer temelindeki iyon değiştirici reçinelerin polimerik iskeleti polistirene çapraz bağlanmış divinilbenzenden sentezlenir.Bu iskelet genellikle bir stirendivinilbenzen (DVB) polimeri, polimetakrilat polimeri, metakrilik asit divinilbenzen (MA-DVB) polimeri veya akrilik asit divinilbenzen (A-DVB) polimeridir. Bunlardan stirendivinilbenzen polimerinin oluşturulması aşağıdaki şekilde gerçekleştirilir:

 

 

Çapraz bağlanmanın miktarı, divinilbenzen miktarı ile kontrol edilir.Genellikle her 11 mol stiren için 1 mol divinilbenzen kullanılır. Çapraz bağlı polimerik zincirlerin oluşturulması için yaygın biçimde p-divinilbenzen kullanılmakla birlikte, m-divinilbenzen de aynı işlevi görür. Polistirendivinilbenzen reçinesinin gözenekliliği ve mekanik kuvveti, çapraz bağlanma derecesinin bir fonksiyonudur. Yüksek dereceli çapraz bağlı reçineler (% 8-10) yüksek basınçta kullanılabilir, fakat küçük çapları yüzünden, makro moleküllerin geçmesine izin vermezler. Düşük dereceli çapraz bağlı reçineler (% 2-8), büyük moleküllerin matrikse geçmesine izin verir ve çözünürlüğü arttırırlar. Fakat mekanik  kararlılıkları  düşüktür. Bu   destek  maddelerinin   avantajı,

pH 2 - pH 12 arasındaki pH aralığında kararlı olmalarıdır.

Katyon değiştiriciler, polimere asidik fonksiyonel gruplar eklenerek, anyon değiştiriciler ise bazik fonksiyonel gruplar eklenerek elde edilirler. En çok kullanılan fonksiyonel gruplar katyon  değiştiriciler  için  -SO3-(sülfonat), anyon değiştiriciler için  kuarter  amin (-N+(CH3)3  trimetilamonyum; -N+(CH3)2C2H4 OH  dimetil hidroksietil amonyum) formundaki  iyon değiştiricilerdir. Örneğin bir stirendivinilbenzen polimeri sülfürik asitle tepkimeye girdiğinde -SO3H bağlı katyon değiştirici oluşturur:

 

 

b. Silika temelinde iyon değiştiriciler: Silika temelinde iyon değiştiren matriksler hidrofiliktir ve polimerik tabaka oluşması için kullanılan çapraz bağlayıcılar yüzünden düşük hidrofobik tutunma gösterirler. Küçük parçacık büyüklükleri ve sık dağılımları yüksek kaliteli bir ayırma sağlar. Gözenekli yüzeylerinden dolayı, hareketli  faza önemli bir temas yüzeyi sağlarlar. Kimyasal ve mekanik olarak kararlı olan silika matriksleri, yüksek akış hızı  gerektiren yüksek basınca karşı iyi direnç gösterirler. 2.5-7 pH aralığındaki sulu tamponlar ve pekçok organik çözücüler, matrikste şişme veya büzülme olmaksızın kullanılabilirler. Bunlar mikro ve makro reçineler arasında orta bir yerde olarak düşünülür ve iyon değiştirme fazı ince polimerik ağa monomerik bağlanmış olabilir. Silika temelindeki reçinenin avantajı, polistiren temelindeki iyon değişitirici reçineden, mL kolon hacmi başına daha büyük değiştirme kapasitesine sahip olmasıdır. Bununla birlikte silika bazlı iyon değiştiricilerin birkaç sınırlaması vardır. Bunların bazik koşullar altında kullanımları sınırlıdır ve yüksek iyonik şiddet kolon ömrünü azaltır.

Iyon değiştirici reçineler, polimere bağlanan asidik veya bazik fonksiyonel grupların kuvvetine göre de sınıflandırılırlar. Bu sınıflandırma kuvvetli bazik (kuvvetli anyon değiştirici), oldukça bazik, zayıf bazik, kuvvetli asidik (kuvvetli katyon değiştirici) ve zayıf asidik şeklindedir. Fonksiyonel grubun bazikliği veya asidikliği arttıkça ters yüklü örnek iyonlarını çekme gücü artar. Tablo 2�de çeşitli katyon ve anyon değiştirici reçineler görülmektedir.

 

  

Tablo 2.     Çeşitli  Iyon  Değiştirici Reçineler

 

Sınıflandırma
Fonksiyonel grup
Polimerik destek

 

Kuvvetli bazik

(kuvvetli anyon değiştirici)

 

 

 

Tetraalkil-amonyum hidroksit

-CH2N(CH3)3+Cl-

-CH2N(CH3)3+OH-

Tetraalkil-amonyumklorür

 

S-DVB

S-DVB

S-DVB

S-DVB

 

Oldukça bazik

 

-N(CH3)2

 

S-DVB

 

Zayıf bazik

 

 

-NH2

-NH2

 

S-DVB

S-DVB

 

Kuvvetli asidik

(kuvvetli katyon değiştirici)

 

-SO3-H+

 

S-DVB

 

Zayıf asidik

 

 

 

-SO3-Na+

-COO-H+

-COO-H+

 

S-DVB

S-DVB

S-DVB

 

 

 

 

Bir sülfonik asit iyon değiştirici, Mx+ katyonu içeren bir çözücü ile etkileştirilirse,

xRSO3-H+  +  Mx+ = (RSO3-)x Mx+  +  xH+

dengesi oluşur. Burada RSO3-H+,  reçineye bağlı birçok sülfonik asit gruplarından bir tanesini göstermektedir. Benzer şekilde bir kuarterner amin grubu Ax- anyonu ile,

xRN(CH3)3+OH-   +  Ax- = [RN(CH3)3+]x Ax-  +  xOH-

tepkimesini oluşturur.

Iyon değişimi dengesine örnek olarak, B+ iyonu ile kromatografik kolona doldurulan sülfonik asit reçinesi arasındaki tepkime gösterilebilir. B+  iyonlarının kolonun başında tutulmasının başlıca nedeni,

RSO3-H+(k)  +  B+(aq) = RSO3-B+(k)  + H+(aq)  

tepkimesidir.Tepkimede kullanılan (k) ve (aq) sembolleri sistemin bir katı ve sulu faz içerdiğini vurgulamaktadır. Böylece çözücü olarak kullanılan hidroklorik asit, yukarıdaki dengeyi sola kaydırarak durgun fazdaki B+ iyonlarının bir kısmının hareketli faza geçmesine neden olur. Bu şekilde devam eden durgun faz ile hareketli faz arasındaki geçişler B+ iyonlarının kolonda aşağıya doğru hareketini sağlar. İyon değişimi tepkimesinin denge sabiti  Kdeğ ,

 

 

 

eşitliği ile verilir.Burada [RSO3-B+]k ve [RSO3-H+]k , B+ ve H+ iyonlarının katı fazdaki derişimleridir.Yukarıdaki eşitlik,

  

şeklinde düzenlenebilir. Çözücünün kolondan geçirilişi sırasında hidrojen iyonlarının sulu fazdaki derişimi, B+ iyonlarının sulu fazdaki derişiminden çok daha büyüktür. Ayrıca reçine, tutulan B+ iyonu sayısı ile karşılaştırıldığında daha fazla sayıda iyon değiştirici uca  sahiptir. Böylece [H+]aq ve [RSO3-H+]k nın toplam derişimleri denge tepkimesinin sola kaymasından pek etkilenmezler. Yani,[RSO3-H+]k>>[RSO3-B+]k ve [H+]aq>>[B+]aq iken yukarıdaki eşitliğin sağ tarafı sabit kabul edilebilir. Böylece

 

 

yazılabilir. Burada K, dağılma katsayısına karşı gelen bir sabittir.

Kdeğ  katsayısı, reçinenin başka bir iyona (burada H+) göre B+ ya olan ilgisini gösterir. Kdeğ büyükse katı fazın B+ iyonunu tutma eğilimi de büyüktür; Kdeğ  küçükse reçinenin B+ yı tutması da az olacaktır. H+gibi bir iyon referans seçilerek, çeşitli iyonların belirli bir reçine üzerindeki dağılma oranları deneysel olarak karşılaştırılabilir. Bu deneyler, çok yüklü  iyonların tek yüklü türlere göre daha kuvvetli tutulduklarını göstermektedir. Belli bir yüke sahip iyonlar arasında ise, hidrate iyonun boyutuna ve diğer özelliklerine bağlı olarak farklılıklar ortaya çıkmaktadır. Tipik  bir sülfonatlı katyon değiştirici reçine için Kdeğ  değerleri Tl+ >Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ > NH4+ > Na+>H+> Li+ sırasıyla azalır. Iki değerlikli katyonlar için bu sıralama Ba2+ > Pb2+ > Sr2+> Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ >Cu2+ >Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > UO22+ şeklindedir. Anyonlar için ise, kuvvetli bazik bir reçine ile Kdeğ değerleri SO42- > C2O42- > I- >NO3- > Br- > Cl-> HCO2- > CH3CO2- > OH- >F- sırasıyla azalır. Bu sıralamalar reçine türüne ve deney koşullarına çok bağlı olduğu için, böyle bir karşılaştırma ancak yaklaşık olarak geçerlidir.

Iyon değiştirme kromatografisinde kullanılacak hareketli faz, diğer kromatografi türlerinde kullanılanlarla aynı genel özelliklere sahip olmalıdır. Yani kullanılacak hareketli faz, örnek maddesini çözmeli, uygun alıkonma sürelerini sağlamalı ve örnekte bulunan bileşenlerle seçimli olarak etkileşmelidir. Inorganik uygulamalar için kullanılacak hareketli fazlar genellikle sulu fazlar olmakla birlikte metanol gibi su ile karışabilen organik çözücüler de içerebilir.

Ayrılacak iyonların iyon değiştirici reçinelerdeki tutulmalarına etki eden en önemli faktör pH� dır.

HA = H+ + A-

şeklinde gösterilen bir zayıf asit tepkimesi için anyon değiştirici kolondan geçen hareketli fazın pH�ı azaldıkça çözeltideki H+ iyonu derişimi artar ve yukarıdaki tepkima sola kayar. Böylece kolondaki A- iyonu sayısı, yani kolonda tutulan anyon miktarı azalır. Benzer şekilde bir zayıf bazın konjuge asidinin diğer bileşenlerden ayrılması için kullanılan katyon değiştirici kolonda  pH azaldıkça  katyonların bağıl sayısı ve buna bağlı olarak  da tutunma miktarı artar. Bu nedenle hareketli fazın pH�ının kontrol edilmesi gerekir. Bu kontrol ile asidik veya bazik denge sabitleri birbirinden farklı olan iyonların birbirinden ayrılması ile mümkün olur.

Linkleri Görebilmek için lütfen Üye girişi yapınız

 
 03. Dedektörler

 

Örnek, hareketli faz ile birlikte kolon boyunca sürüklenerek dedektöre taşınır. HPLC cihazlarında kullanılan dedektörler, diğer sıvı kromatografisi cihazlarında kullanılan dedektörlerle aynıdır. Analizin amacına göre UV absorpsiyon, kırılma indisi, floresans ve elektrokimyasal dedektörler kullanılır. Ideal bir dedektör şu özelliklere sahip olmalıdır:

I.     Düşük gürültü seviyesine sahip olması nedeniyle ayrılan bileşenlerin küçük miktarları gözlenebilir.

·        Hızlı ayrılan pikleri kaydetmek için süratli cevap zamanına sahiptir.

·        Hareketli fazdaki akış hızı, sıcaklık ve fazın bileşimindeki değişimlere karşı bir dereceye kadar duyarsızdır.

·        Bütün çözünenlere cevap verir veya  en azından tahmin edilebilir bir seçiciliğe sahiptir.

·        Kolay çalışır ve güvenilirliği fazladır.

·        Oluşan pikte kalitatif bilgi de sağlar.

 

HPLC dedektörlerinin iki tipine rastlamak mümkündür.

1.    Genel dedektörler

2.    Seçici dedektörler

 

Genel dedektörler, hareketli faz ve örnek çözeltisinin özelliklerindeki değişimi ölçer. Seçici dedektörler ise yalnız örnek çözeltisi için duyarlık ve seçicilik gösterir. Genel özellikli  dedektörlere örnek olarak kırılma indisi ölçen dedektörler ve kütle spektrofotometreleri verilebilir. Seçici dedektörlere örnek olarak da UV, FT-IR, floresans, elektrokimyasal, radyokimyasal, iletkenlik dedektörleri verilebilir.

UV absorpsiyon dedektörü, kolondan ayrılarak dedektöre ulaşan bileşenlerin ultraviyole bölgede yaptığı absorbansın ölçümüne dayanır. Tek bir dalga boyunda  çalışan dedektörler kullanılabildiği gibi bir monokromatör ile çeşitli dalgaboylarını seçerek çalışan dedektörler de vardır. Tek dalgaboyunda çalışan dedektörlerde ışık kaynağı olarak genellikle 254 nm�de ışıma yapan Hg lambası, çeşitli dalgaboylarını ölçebilen dedektörlerde ise döteryum lambası kullanılır. Spektrofotometrik ölçüm temeli ile çalışan bir başka dedektör türü ise fotodiyot dizisidir. Ölçümlerin çok hızlı bir biçimde yapılmasının gerektiği analizlerde genellikle bu dedektör kullanılır. UV dedektörün karakteristikleri şunlardır:

*     Örneklerin UV- görünür bölgede absorpsiyon yapması gerekir.

*     Hareketli faz akış hızı ve sıcaklık değişimlerinden etkilenmez.

*     Band genişletme etkisi küçüktür.

*     Çok güvenilirdir, operasyonu kolaydır.

*     Örnek çözeltiyi bozmaz.

Floresans özellikleri taşıyan bileşiklerin analizinde ise spektrofotometrik dedektörlere oranla duyarlığı daha fazla olan floresans dedektörlerin kullanılması mümkündür. Bu dedektör ile 10-11 g/mL gibi çok düşük gözlenebilme sınırlarına inilebilmektedir. Luminesans özelliğine sahip olan ilaçların, aminoasitlerin tayini yapılabilir yada bazı biyokimyasal bileşikler floresant bir madde ile tepkimeye sokulup, yeni bir floresant ürün veya etiketlendirilmiş ürün oluşturulur. Örneğin; aminoasit ve proteinlerin bulunduğu bir karışım, 5-Dimetilaminonaftalinsulfonikasitklorürü ile Dansil bileşiklere çevrilir ki bunlar keskin bir floresans gösterirler. Bu yolla bu bileşiklerin 10-16 mol�a kadar tayini yapılabilir.

10-11- 10-12 g/mL değerinde gözlenebilme sınırına ulaşılan elektrokimyasal dedektörler, elektroliz sonucu akım ölçülmesi ilkesine göre çalışır. Burada ölçülen akım, örnek maddesinin elektrolizi sonucu oluştuğundan kullanılan çözücünün elektrik akımı vermemesi gerekir. Elektrokimyasal redoks tepkimelerine cevap veren ve  polarografi ilkesine dayanan HPLC dedektörü de yaygın olarak kullanılır.

Iletkenlik dedektörleri kolondan çıkan iyonik haldeki bileşenlerin ölçümünde kullanılır. Bu dedektör organik sistemler için pek uygulanabilir değildir. Daha çok sulu sistemlere uygundur.

Tüm bileşenleri ölçebilen, yani seçimli olmayan kırılma indisi dedektörü ile yapılan ölçümlerde, kırılma indisi sıcaklıkla değiştiğinden, çok iyi bir sıcaklık kontrolü yapılmalıdır. Çok yönlülüğü mükemmeldir, fakat duyarlılığı vasat olduğundan eser analizler için ideal değildir.

 

 

04. HPLC Kullanırken Alınması Gereken Önlemler

 

04.01.Hareketli  faz çözücüleri için önlemler

I.     Farklı dolgulu kolonlar için çözücü sınırlaması: Silika dolgulu bir kolon kullanıldığında, kullanılan hareketli fazın pH�ına dikkat edilmelidir. Uygun pH aralığı  2- 7.5 arasındadır. Gözenekli polimere sahip bir kolonun çözücüsünü değiştirirken, kolon maddesinde şişme veya büzülme olup olmadığına dikkat edilmelidir. Dolgu maddesinin şişmesi, su yüzdesiyle artar. Asit, baz, tuz veya iyon çifti reeaktifi kullanıldıktan sonra  kolon, metanol/su karışımı ile temizlenmelidir.

·        Çözücünün saflığı: HPLC�de kullanım için mümkün olan en yüksek saflıkta bir çözücü önerilir.

·        Çözücünün degaze edilmesi: HPLC�de,  eğer hava, hareketli  fazda, yüksek basınç altında çözünürse, pompa başında veya dedektör hücresinde, doğru analize imkan vermeyen , hava kabarcıkları oluşur. Bu yüzden mobil faz olarak kullanılan çözücü tamamen degaze edilmelidir. Degaze işlemi özellikle, gazların kolayca çözündüğü  su, alkol ve asetonitril veya bunların karışımı için gereklidir.

·        Çözücünün süzülmesi: HPLC  çözeltileri, kullanılmadan önce daima süzülmelidir. Eğer süzülmeden kullanılırlarsa, kolon filtresi ve kolon başı tıkanabilir. Bunun sonucunda duyarlığın azalması, basıncın artması ve kolon ömrünün azalması gibi değişik problemler ortaya çıkabilir. Sulu ortamda süzme genellikle selüloz ester karışımı 0.22 mm gözenek büyüklüğüne sahip filtrelerle, organik ortamda süzme ise 0.2 mm gözenek büyüklüğündeki politetrafloroetilen filtrelerle yapılır veya  HPLC çözücüsü için özel süzme aleti kullanılabilir.

·        Çözücülerin değişimi: Eğer çözücü değiştirilecek olursa, diğer çözelti ilkiyle iyi karışabilir olmalıdır. Bu durum yalnızca pompanın düzensiz çalışmasına yol açmaz,aynı zamanda kolon ve dedektörü de kararsız hale getirir. Bir tampon kullanıldıktan hemen sonra organik bir çözücü kullanılırsa, HPLC sistemi tuzların çökmesi yüzünden çalışamaz hale gelir. Bu kolonun ömrünü de etkileyebildiğinden, organik çözücü kullanılmadan önce sistem su veya ara polaritede bir çözücü ile temizlenmelidir.

 

04.02. Kolon kullanımı için önlemler

I.     Kolon seçimi: Örneğin molekül kütlesi, solvent sisteminin çözünürlüğü, ayırma modu gibi bilgiler performanslı bir ayırmadan önce kolon seçimine yardım eder. Üreticiler kolon dolgu maddelerini, ayırdıkları bileşikler, örnek kapasiteleri vb. şekilde sınıflandıran bir literatür sağlamışlardır.

·        Ön-kolon kullanımı: Hareketli faz, pompa çıkışından sonra, ayırmayı sağlayan kolon ile aynı sabit fazı içeren bir ön-kolondan geçirilir. Bu uygulamanın amacı, hareketli fazdaki safsızlıkları toplamak ve hareketli fazı sabit faz ile doygunluğa getirmektir. Ön-kolon kullanmanın bir diğer avantajı ise fiyatları bir hayli yüksek olan ayırıcı kolonların ömrünü uzatmasıdır.

·        Kolon tabakasının bozulması: HPLC sistemi çalıştırılmaya başlanınca akış hızı yavaş yavaş arttırılmalıdır. Aynı uygulama sistem kapatılırken de izlenmelidir. Böylece kolon tabakasının bozulmaksızın kolon basıncının artması sağlanır.

·        Kolonun korunması: Kolonlar rutubetli ve çok yüksek veya çok düşük sıcaklıkların olduğu yerlerde saklanmamalıdır.  Kolonların özel bir çözücü ile saklanması, kirlenmeyi azaltır ve kolon ömrünü artırır. Bazı tamponlar (özellikle halojen tuzlarını içeren tamponlar) kolonun paslanmaz çelik duvarını aşındırır. Bu nedenle kolon saklanmadan önce uygun bir çözücüyle temizlenmelidir.

·        Kolonun rejenerasyonu (yenilenmesi):  Kolon performansı azaldığında en iyisi kolonu rejenere etmektir. Normal faz kolonları kullanıldığında, kolon önce çok az polarlıkta bir çözücü geçirilerek yenilenebilir ve sonra tekrar hareketli fazla dengeye getirilir. Ters faz kolonları metanol, THF, CH2Cl2 gibi çözücülerle  yenilenebilir.

  

05. Örnek hazırlanması

Katı örnekler: Bir örneği HPLC sistemine vermek için, bu örneğin, hareketli faz olarak kullanılan çözücüde çözünmesi gerekir. Örneğin, metanol/su karışımı bir hareketli fazla ile analiz yapılacaksa, örnek metanolde, suda veya metanol/su karışımında çözülmelidir. Eğer örnek böyle bir çözücüde çözünmüyorsa, diğer bir çözücüde çözünmeli, fakat bu durumda kullanılan çözücü kesinlikle hareketli fazla karışabilir olmalıdır. Örnek bileşenlerinin, mobil faz çözücüsünde çökmemesine de dikkat edilmelidir.

Sıvı örnekler: Sıvı örneklerde  çözücü, sistem ile uyumluysa, doğrudan enjekte edilebilir. Eğer örnekler istenen çözücüde değillerse veya enjekte edilecek kadar derişik değillerse, kurutulmalıdır veya deriştirilmelidir. Daha sonra hareketli fazda tekrar çözünmelidir.

Örneklerin süzülmesi: Hareketli faz akışında azalmaya, geri basıncında artmaya, kolon veriminde azalmaya ve istenmeyen piklere neden olabilecek  çözünmeyen maddelerin kolona girmesini önlemek için, örneğin enjeksiyondan önce süzülmesi tavsiye edilir.

 

 

03.06. Dedeksiyon sisteminin korunması

Dedeksiyon hücresinde gaz kabarcıkları oluşursa, tayinde problemler ortaya çıkar. Gaz kabarcığının oluşumunu önlemek için şu önlemler alınmalıdır:

·        Sistemde sızıntı olmamalıdır.

·        Solvent HPLC sisteminde kullanılmadan önce degaze edilmelidir.

·        Eter, pentan  gibi uçucu solventler sistemde buharlaşacağından, bunları kullanmaktan kaçınılmalıdır.

 

07. Uygulamalar

 

 

HPLC sistemi ile hangi analiz yapılacak ise öncelikle o analiz icin gerekli şartlar sağlanır.  Analiz yapılacak numuneden, analiz yapılacak bileşenin saf olarak ayrıştırılabilmesi için uygun ekstraksiyon yöntemi bulunur.  Daha sonra o analiz icin uygun kolon, haraketli faz ve akış hızının şeçilmelidir.

Bütün bu şartlar yerine getirildikten sonra analiz edilecek maddenin bilinen bir derişimdeki standartı sisteme enjeksiyon edilir. Standart çok saf olduğu için deney sonucunda sadece tek pik gözlenmelidir. Standartın kolondan çıkış süresi (alıkonma süresi) tespit edilir. Analiz edilecek çözelti sisteme enjekte edildiği zaman elde edilen kromatogramda değişik zamanlarda gelen birden fazla  pik olması muhtemeldir. Bu nedenle de standartın alıkonma süresine denk gelen pik o kromatogramda bizim aradığımız pik olacaktır.

Daha sonra derişimi bilinen standartın verdiği pikin altında kalan alan veya pik yüksekliği ( h) hesaplanır. Örnek kromotogramındaki yeri tespit edilen bilinmeyen bileşenin pikinin altında kalan alan veya yükseklik hesaplanır. Sonuçta orantı hesaplaması ile analiz edilen bileşenin derişimi hesaplanır.

 

                          

 

 www.kimyaevi.org





“ Sevdiklerinize bir gül verin; gülünüz yoksa gülüverin.. ”
Başa dön
chem_87 Açılır Kutu Gör
Üye
Üye
Avatar

Kayıt tarihi: 24.Nisan.2011
Konum: ankara
Durum: Offline
Puanlar: 1
Süreç Yönetimi Eğitimi
Mesaj Seçenekleri Mesaj Seçenekleri   Teşekkürler (0) Teşekkürler(0)   Alıntı chem_87 Alıntı  Cevap YazCevap Mesajın Direkt Linki Gönderildi: 24.Nisan.2011 saat 17:43
slm!
ben foruma yeni üye oldum. başlık altındaki mesajları göremiyorum. ayrıca bu metinden alıntı yapmak istiyorum, kaynak göstermeniz mümkün mü?


chem_87
Başa dön
osmanbedel Açılır Kutu Gör
Yönetici
Yönetici
Avatar

Kayıt tarihi: 01.Ocak.2006
Konum: İstanbul
Durum: Offline
Puanlar: 703
Süreç Yönetimi Eğitimi
Mesaj Seçenekleri Mesaj Seçenekleri   Teşekkürler (0) Teşekkürler(0)   Alıntı osmanbedel Alıntı  Cevap YazCevap Mesajın Direkt Linki Gönderildi: 26.Nisan.2011 saat 16:32
resimler kaynaktan silinmiş bu yüzden görünmüyor.


Başa dön
osmanbedel Açılır Kutu Gör
Yönetici
Yönetici
Avatar

Kayıt tarihi: 01.Ocak.2006
Konum: İstanbul
Durum: Offline
Puanlar: 703
Süreç Yönetimi Eğitimi
Mesaj Seçenekleri Mesaj Seçenekleri   Teşekkürler (0) Teşekkürler(0)   Alıntı osmanbedel Alıntı  Cevap YazCevap Mesajın Direkt Linki Gönderildi: 27.Mayıs.2011 saat 09:19
Genel Olarak Kromotografi Nedir?

Kromatografi, bir karışımdaki iki ya da daha fazla bileşenin, hareketli (taşıyıcı) bir faz yardımıyla, sabit (durgun) bir faz arasından değişik hızlarda hareket etmeleri esasına dayanır. Kromatografik yöntemlerle, kimyasal ve fiziksel özellikleri birbirine çok yakın bileşenlerden oluşan karışımları, tümüyle, kolayca ve kısa sürede ayırmak olanaklıdır.
Kromatografide durgun faz, bir katı veya katı yüzeyine kaplanmış bir sıvı fazdır. Durgun fazın üzerinden akan hareketli faz ise bir gaz veya sıvı fazdır. Hareketli fazın sıvı olduğu kromatografi türüne Sıvı Kromatografi (SK); hareketli fazın gaz olduğu kromatografi türüne ise Gaz kromatografi denir. Gaz kromatografi (GK), gaz, uçucu sıvı ve katı karışımlar için uygulanan bir tekniktir. Sıvı kromatografi ise özellikle ısıl kararsız ve uçucu olmayan örnekler için uygulanır.
Nitel ve nicel analiz tekniği olan kromatografide amaç, anlamlı bir süre içinde iyi bir ayırma yapmaktır.
Ayırmayı etkileyen parametreler aşağıdaki gibi özetlenebilir:

Kolon ile ilgili olanlar : Türü, Boyutları, Akış Hızı

Hareketli faz ile ilgili olanlar: Hareketli Fazın Türü ve Bileşimi

Ölçüm ile ilgili olanlar: Dedektör Türü, Dalga Boyu

Örnek ile ilgili olanlar: Örnek Derişimi ve Hacmi


Sıvı Kromotografi


Linkleri Görebilmek için lütfen Üye girişi yapınız

Sıvı kromatografi bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPLC) denir.
Gaz ve sıvı kromatografinin uygulama alanları farklıdır; ancak birçok bileşen her iki kromatografiyle de ayrılabilir. Amaca uygun seçim yapılır: Kromatografiyle ayrılan maddelerle daha başka işlemler yapılacaksa bunların toplanması istenir. Toplama işleminde, Gaz kromatografisinde taşıyıcı faz gaz olduğundan ortamdan hemen uzaklaşır ve saf madde uygun bir soğutma sistemiyle kolayca sıvı veya katı halde elde edilebilir. Sıvı kromatografi- sinde, taşıyıcı faz sıvı olduğundan, saf madde ile birlikte gelen taşıyıcı sıvının uzaklaştırılması için ek işlemler yapılmalıdır. Bu koşulda gaz kromatografisi tercih edilir. Sıvı kromatografi (SK), ayrılacak bileşik ısıya karşı duyarlıysa veya büyük moleküllüyse kullanılır.

Sıvı Kromatografi Birimleri ve Özellikleri

SK aşağıdaki temel birimlerden oluşur.
Hareketli/ Taşıyıcı Faz Deposu
Taşıyıcı Faz Hareket Birimi; Pompa(lar)
Enjeksiyon (Örnek Yükleme) Birimi
Ayırma Birimi ; Kolon(lar)
Ölçüm Birimi; Dedektör(ler)
Yazım Birimi; kaydedici, İntegratör
Atık Deposu

Sıvı kromatografisinde ayırmaya etki eden değişkenlerden bir tanesi hareketli fazdır. İyi bir hareketli faz; sabit fazın özelliklerini değiştirmemeli, örnekteki bileşenlerin hepsini çözmeli, düşük viskozitede olmalı, (gerektiğinde) ayrılan bileşenlerden kolayca ayrılabilmeli (kolayca buharlaşabilmeli), kullanılan dedektöre uygun olmalı, ekonomik ve istenen saflıkta kolayca bulunabilir olmalıdır. Yüksek basınçta yapılan kromatografide, sisteme verilmeden önce, hareketli fazın içerisindeki çözünmüş gazlar uzaklaştırılmalıdır; aksi halde sistemin düşük basınçlı kısmı olan dedektörde, çözünmüş gazlar (özellikle hava) kabarcık oluşturur. Bu durum, dedektörden çok hatalı değerler alınmasına neden olur. Hareketli fazdan gaz uzaklaştırma işlemi ısıtma veya vakum uygulayarak olur.10-60 ml/h akış hızını elde etmek için hareketli faza uygulanan basınç, 30-400 atm arasında değişir.

Hareketli fazı kolona gönderen pompadır. Hareketli faz pompalama sistemi, vuruntusuz akış oluşturmak üzere çift pistonlu bir pompa içerir. Pistonların biri emerken diğeri bastığından SK için çok önemli olan düzgün akış elde edilir. Pompa debisi 0.1 ml/dk hassasiyetle ayarlanabilir. Pompa hareketli faz deposundan aldığı çözücüyü önce enjeksiyon sistemine gönderir. Örneğin rahat yüklenmesi ve hareketli faz akışının enjeksiyondan etkilenmemesi için örnek çok uçlu bir vananın içerdiği kangala verilir. Vananın pozisyonu değiştirilerek hareketli fazın kangaldan geçmesi, dolayısıyla enjeksiyon sağlanır.

Çözücü enjeksiyon sisteminden geçtikten sonra, SK sisteminin ayırma birimi olan kolona gelir. SK kolonları paslanmaz çelik veya kartuş şeklindedir. Analitik ya da preparatif amaçlı olabilirler. Analitik kolonlar, yani kantitatif analiz amaçlı olanlar 2-8 mm iç çaplıdırlar ve uzunlukları içerdikleri dolgu tipine göre 10-100 cm arasında değişir. Bir karışım içinde istenen bileşenleri ayırarak elde etmeye yönelik olan preparatif kolonlar genellikle 6 mm çaplı 25-100 cm uzunluğunda kolonlardır. SK türleri kullanılan kolona göre aşağıdaki gibi sınıflandırılır.

Adsorpsiyon (Sıvı-Katı) Kromatografi
Partitisyon (Sıvı-Sıvı) Kromatografi
İyon Değişimi Kromatografi
Moleküler Eleme (Jel) Kromatografi

SK koşulları iyi ayarlandığında, kolonda birbirinden ayrılan maddeler taşıyıcı faz ile birlikte ölçüm birimi olan dedektöre gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir. Bu amaçla; Absorbans Dedektörü, Floresans Dedektörü, Kırılma İndisi Dedektörü, Elektrokimyasal Dedektör ve İletkenlik Dedektörü kullanılabilir. Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen sıvının -sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler. Floresans dedektörler, belli bir dalga boyunda ışığı absorpladıktan sonra başka bir dalga boyunda ışın yayan yani florasans özellik gösteren maddelerin yaydığı ışık şiddetini ölçerler. Kırılma indisi dedektörleri ise akış hücrelerinden geçen akımın kırılma indisini ölçerler. Absorbans dedektörü kullanılırken seçilen dalga boyunun, ışığın % 90’ının absorplandığı dalga boyu olarak tanımlanan, çözücü uv-cut off değerinden yüksek olmamasına dikkat edilmelidir. Bu durum, özellikle düşük dalga boylarında absorpsiyon yapan örnekler için önemlidir. Akış hücresine gelen madde derişimi ve/veya cinsi değiştiğinde dedektör sinyalinde değişiklik olur. Kaydedici, zamana göre dedektörden gelen sinyali (voltaj değişimini) kaydeder .

Sıvı Kromotografi Yöntemleri

Adsorpsiyon Kromatografi
Ayrılacak bileşenlerin sabit katı faz üzerinde tersinir olarak adsorblanmaları esasına dayanır. Burada hareketli faz, adsorban üzerinde sıvı olarak hareket eder. Bileşenler birbirlerinden katı yüzeye olan farklı derecede ilgileri nedeniyle ayrılırlar. Adsorpsiyon denge sabiti büyük olan bileşen yüzeyde daha uzun kalırken, küçük olan daha kısa sürede kalmakta, hiç adsorplanmayan bileşen ise kolonda hiç geciktirilmeden hareketli faz ile taşınarak dışarı çıkmaktadır. Yüzeye adsorplanan bileşenler ise yüzeyle etkileşmelerine bağlı olarak farklı kalma sürelerinde kolonu terketmektedir.
Adsorpsiyon kromatografisinde sabit faz olarak adsorplama yapabilecek bir katı kullanılır. En çok kullanılan yüzeyleri polar sabit fazlar alümina ve silikajeldir. Sabit faz olarak genellikle polar katılar kullanıldığından, hareketli faz olarak apolar veya çok az polar sıvılar kullanılır; benzen, oktan, kloroform gibi. Ayrılacak bileşenin sabit fazla etkileşmesi dipol-dipol çekmeleri, Van Der Waals kuvvetleri veya hidrojen bağları sonucunda gerçekleşir.
Adsorpsiyon kromatografisi, polarlıkları farklı bileşenlerden oluşan karışımların ayrılmasında iyi sonuç verir. Durgun fazın polaritesi, sabit fazın polaritesinden daha büyük olduğunda buna ‘Normal Faz Kromatografi’, hareketli fazın polaritesi daha büyük olduğunda buna, ‘Ters Faz Kromatografi’ denir.Bu tip kromatografide, nicel analizlerde adsorpsiyon izoterminin derişime göre doğrusal olduğu bölgelerde hatasız çalışılabilir. Doğrusal kısım zayıf adsorplanan bileşik için geniştir; bu nedenle nicel çalışmada zayıf adsorplama istenir.

Partitisyon Kromatografi
Bu kromatografi türünde ayrılacak bileşenin, durgun sıvı ile çözücü arasındaki dağılma oranı ayrılmanın ne kadar başarılı olacağını belirler. Bu nedenle dağılma kromatografisi olarak da adlandırılır.
Destek katısı üzerine kaplanan bir sıvı sabit fazı oluşturur, diğer sıvı da hareketli fazı oluşturur: Bu kromatografi, bu iki sıvı fazda çözünürlüğü farklı olan her bileşeni ayırmada kullanılabilir. Ayırma, bileşenin iki fazdaki dağılma oranına göre gerçekleşir. Burada sabit faz ve hareketli faz karışmamalı ve birbirlerini çözmemelidir. Durgun fazda çözünürlüğü yüksek olan bileşenler kolonda uzun süre kalırken, çözünürlüğü düşük olanlar daha kısa süre kalır. Sabit faz ayrılacak bileşen için iyi bir çözücü, fakat hareketli faz için kötü bir çözücüdür; yani iki fazın polarlıkları farklı olmalıdır. Hareketli fazın durgun fazdan daha az polar olduğu sistemlere normal faz kromatografi; tersi duruma ters faz kromatografi denir.

Fiziksel olarak destek katısı üzerine tutturulmuş durgun sıvı, taşıyıcı sıvı tarafından kolayca sürüklenip götürülebilir (kolon kanaması) ve destek katısı üzerindeki durgun fazın miktarı zamanla değişir. Böylece kolonlarla yapılan ayırmaların, tekrarlanabilirliliği az olmakta, kolon kısa zamanda işe yaramaz duruma gelmektedir. Bunu önlemek için sabit faz katı destek üzerine kimyasal olarak bağlanmaktadır. Böylece kolonların ömrü uzun olmakta ve tekrarlanabilir ayırmalar gerçekleşmektedir.

İyon Değişimi Kromatografi
Çözeltideki iyonların ters yüklü destek katısı iyonlarına olan ilgisine dayalı bir ayırmadır. Durgun faz zayıf ya da kuvvetli, katyon ya da anyon değiştirici bir reçinedir. Reçinenin sabit yükü (-) ise buna ‘katyon değiştirici reçine’, (+) ise de ‘anyon değiştirici reçine’ adı verilir. Analiz sırasında reçinenin tamamen iyonlaşmış durumda olması gerekmektedir. Hareketli faz genellikle tamponlanmış: istenen iyonların oluşmasına neden olan belli bir pH değerinde sulu çözeltidir ve yükü katının sabit yükünün tersi olan ‘zıt iyonu’ içerir. Yükü, hareketli fazın zıt iyonları ile aynı olan iyonik yapıdaki örnek bileşenleri katıya bağlanmak için zıt iyonlarla yarışırlar. Zıt iyonu yerinden ederek katıya kuvvetle bağlanan –uygun yükte- bileşenler kolonda uzun süre kalırken, katıya zayıfça bağlanan, uygun yükte olmayan veya yüksüz olan bileşenler kolonu çabuk terkeder.

Moleküler Eleme Kromatografi
Kimyasal olarak inert olması gereken katı faz, bir jel ya da gözenekli bir organik bileşiktir. Hareketli faz katı gözeneklerini doldurmuştur. Ayırma, örnek bileşenlerinin molekül büyüklüklerine göre olur. En içteki gözeneklere ulaşabilen küçük moleküllü bileşenler, kolonda uzun süre kalırken, büyük moleküllüler daha kısa süre kalırlar. Değişik türde sabit fazlar kullanılabilir ve bu sayede aynı anda farklı büyüklükteki partiküllerde birbirinden ayrılabilir. İyi bir ayırma gerçekleşmediği zaman pik genişlemesi gözlenir.


Başa dön
Bunları da inceleyiniz ...
TÜRKÇE SÖZLEŞME ÖRNEKLERİ Depo ve Stok Yönetimi
ÜCRETSİZ PROGRAMLAR MS project ile Proje Yönetimi ve planlama
Karne Ortalaması Hesaplama Programı Satın Alma yönetimi ve Teknikleri Eğitimi
Bilgisayar ve internet için gerekli programlar Yöneticilik ve Yönetim Becerileri
Bu sitelerden alışveriş yapabilirsiniz Süreç Yönetimi
Teşekkür Mektubu Örneği İşletme Bütçeleri ve Bütçe Kontrol Teknikleri
ISO9001:2008 KALİTE YÖNETİM SİSTEMİ NASIL ALINIR Mali Tablolar Analizi Eğitimi
 Cevap Yaz Cevap Yaz
  Konuyu Paylaş   

Foruma Atla Forum İzinleri Açılır Kutu Gör



Bu sayfa 0,344 saniyede yüklenmiştir.

Mühendislerin Buluşma Mekanı

Tavsiye Siteler

www.biymed.com   www.biymed.com.tr   www.AKILveZEKA.com   www.EgitimDuyurulari.com   www.begitim.com

ziyaretçi sayımız :